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失活,因而極難消除,對保持RNA樣品的完整性構(gòu)成極大的威脅。由于RNase A類酶依賴于活性位點處的組氨酸殘基起催化作
用,因此能被組氨酸烷化劑DEPC所抑制。為了避免RNA降解,RNA相關(guān)實驗都嚴(yán)格應(yīng)遵循下述操作規(guī)則:
? 使用RNase-free溶液;
? 佩戴清潔一次性手套并經(jīng)常更換;
? 建立RNA工作專區(qū),使用專用的移液器和RNase-free槍頭;
? 使用無菌的一次性塑料器皿,盡量避免使用玻璃器皿;
? 金屬工具可以用快速灼燒數(shù)秒鐘的方式來快速消除污染;
? 玻璃器皿可在180oC以上溫度下烘焙數(shù)小時,或用新鮮配制的0.1%(v/v)DEPC或無水乙醇浸泡一小時后,高壓滅菌去除殘余
的DEPC;
? 電泳槽等含聚碳酸脂或聚苯乙烯材料的器皿應(yīng)該在3%的過氧化氫中浸泡10分鐘,然后用大量的RNase-free水沖洗干凈后使用;
? 塑料制品可用新鮮配制的0.1%(v/v)的DEPC水浸泡過夜,然后高溫高壓滅菌1小時水解殘留的DEPC;
? 試劑處理:
每升溶液中加入1 ml的DEPC,室溫振蕩過夜或37oC振蕩1小時后,高溫高壓滅菌1小時水解殘留的DEPC;
由于DEPC可以和初級氨基基團(tuán)起反應(yīng),故含Tris的溶液不宜用DEPC處理。應(yīng)使用新開瓶(RNA專用)的Tris粉末,溶于DEPC處理水或Milli-Q水中,使用RNA專用電極調(diào)整pH值后,高溫高壓滅菌;
對于遇熱不穩(wěn)定的化合物(如DTT、核苷、錳鹽等),應(yīng)直接將其(最高純度)溶于DEPC處理水或Milli-Q水中,使用0.2 μm的濾膜過濾滅菌;
無水乙醇、異丙醇等試劑開瓶后作RNA專用;75%乙醇應(yīng)使用無水乙醇與DEPC處理水配制。
? 反應(yīng)體系中添加RNA酶抑制劑。