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核酸抽提中的樣品的裂解和純化方法，原理和注意事項
核酸抽提經(jīng)驗及原理 1：核酸抽提原理 簡單地講，核酸抽提包含樣品的裂解和純化兩大步驟。裂解是使樣品中的核酸游離在裂解體系中的過程，純化則是使核酸與裂解體系中的其它成分，如蛋白質(zhì)、鹽及其它雜質(zhì)徹底分離的過程。 經(jīng)典的裂解液幾乎都含有去污劑 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和鹽 (如Tris、EDTA、NaCl 等)。鹽的作用，除了提供一個合適的裂解環(huán)境 (如 Tris)，還包括抑制樣品中的核酸酶在裂解過程中對核酸的破壞(如 EDTA)、維持核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定 (如 NaCl)等。去污劑則是通過使蛋白質(zhì)變性，破壞膜結(jié)構(gòu)及解開與核酸相連接的蛋白質(zhì)，從而實現(xiàn)核酸游離在裂解體系中。裂解體系中還可能加入蛋白酶；利用蛋白酶將蛋白質(zhì)消化成小的片段，促進核酸與蛋白質(zhì)的分開，同時，也便于后面的純化操作以及獲得更純的核酸。也有直接使用高濃度的蛋白質(zhì)變性劑 (如GIT、GuHCl 等) 裂解的，該方法已經(jīng)成為了 RNA 抽提的主流，卻不是基因組 DNA 抽提的主流。 最常用的純化方法，一是PC 抽提 + 醇沉淀，二是介質(zhì)純化。第一種方法是利用 PC對裂解體系進行反復(fù)抽提以去除蛋白質(zhì)，實現(xiàn)核酸與蛋白質(zhì)的分離；再用醇將核酸沉淀下來，實現(xiàn)核酸與鹽的分離。第二種方法則是利用某些固項介質(zhì)，在某些特定的條件下，選擇性地吸附核酸，而不吸附蛋白質(zhì)及鹽的特點，實現(xiàn)核酸與蛋白質(zhì)及鹽的分離。高鹽沉淀去除蛋白質(zhì)是第一種純化方法的一個變體，省略了 PC操作的麻煩。當然，也有不純化的抽提方法，但是用途多局限于簡單的 PCR。其它雜質(zhì) – 如多糖、多酚等 -的去除，基本上都是在這兩種方法的基礎(chǔ)上，通過增加一些特別的試劑，或者增加一些額外的步驟來實現(xiàn)的。 2：了解你的實驗樣品 如果你研究某個實驗樣品，并且要抽提它的核酸，以下的信息一定要先行收集：該樣品的核酸含量、酶含量、特殊雜質(zhì)含量。如果你對樣品的特點一無所知，當樣品稍微有一點復(fù)雜時，抽提核酸的實驗就會碰到許多問題。以血液為例，如果你不知道鳥的血液中有核細胞的含量是人血的千倍左右，而使用人血一樣的起始量去抽提鳥血的基因組 DNA，怎么可能成功？失敗了又怎么知道原因所在？同時，只有對實驗樣品有所了解，才能正確選擇裂解方法。 絕大部分情況下，使用新鮮樣品可以獲得最好的結(jié)果。對一些雜質(zhì)含量高的樣品，如果使用新鮮樣品抽提基因組 DNA 是碰到雜質(zhì)殘留過大的問題，可以試一下 -20C保存一天后再抽提的對策，可能會有意想不到的效果。樣品如果因為某些原因必須先行保存，也要先簡化一下樣品：血液最好只保存有核細胞；將樣品分割后保存，避免反復(fù)凍融。如果實驗室不具備合適的保存條件，將樣品先裂解后再保存，是一個不錯的選擇。 3：裂解方法的評價 含蛋白酶的裂解方法，可以認為是抽提基因組 DNA 的首選。裂解包括膜蛋白的游離和與基因組 DNA相連接的蛋白質(zhì)的游離。蛋白酶的作用是使蛋白質(zhì)變小，故而對蛋白質(zhì)的游離有巨大的促進作用；同時，巨大的基因組 DNA是很容易“纏”住大分子的東西的，蛋白質(zhì)被蛋白酶消化變小后，則不容易被基因組 DNA“纏”住，有利于蛋白質(zhì)在純化操作中的去除，使最終獲得的基因組 DNA 的純度更高。另外一個思路是，如果基因組 DNA 與蛋白質(zhì)“纏”在一起，在純化的過程中有兩種可能：如果基因組 DNA 的特性占優(yōu)勢，則純化時以 DNA的形式被保留下來，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的殘留；如果蛋白質(zhì)的特性占優(yōu)勢，則純化時以蛋白質(zhì)的形式被去除，導(dǎo)致 DNA 的損失。有些樣品，如肌肉，即使是RNA 抽提，也強烈建議使用含蛋白酶的裂解液 (或者在操作中的某個時候使用蛋白酶消化蛋白質(zhì))，原因在于這些樣品中的蛋白質(zhì)，是非常難以去除的。該方法是獲得最大得率和最高純度的基礎(chǔ)。 不使用蛋白酶的去污劑裂解方法，仍然在細胞基因組 DNA抽提方面有優(yōu)勢，尤其是當?shù)寐屎图兌纫蟛皇亲罡撸?jīng)濟性及操作簡單很重要時?？刂坪昧呀庖?樣品的比例是該方法成功的關(guān)鍵。該方法結(jié)合高鹽沉淀，可以實現(xiàn)最簡單的操作，但純度及得率的穩(wěn)定性可能會比用 PC 抽提的差一些。 高濃度蛋白質(zhì)變性劑 (如 GIT、GuHCl 等)的裂解方法，是抽提 RNA 的首選?？?RNA 的抽提，最重要的是快速裂解細胞膜，至于與基因組 DNA 相連接的蛋白質(zhì)的裂解以及基因組與蛋白質(zhì)“纏”住的問題，因為都不會對以后的純化產(chǎn)生大的影響，可以不考慮。高濃度蛋白質(zhì)變性劑能快速破壞細胞膜，進而迅速抑制住細胞內(nèi)的 RNA酶，從而確保了 RNA 的完整性。除了極少量不適用該方法的樣品 – 主要是植物，其它絕大部分樣品的 RNA的抽提，都可以以高濃度的蛋白質(zhì)變性劑為基礎(chǔ)的。該方法也可用于基因組 DNA 抽提，非?？焖俸唵?，但純度不是很高。 含 CTAB的裂解液，幾乎成為富含多糖的樣品，如細菌、植物的基因組 DNA 抽提的首選裂解方法。