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real-time PCR 常用儀器和探針
1.SYBR Green I：
一種DNA結(jié)合染料，能非特異性地與雙鏈DNA結(jié)合，結(jié)合后發(fā)出熒光，價格便宜，但因無特異性，易受到非特異性擴增和引物二聚體地的影響，是定量結(jié)果不可靠。可用融解曲線分析區(qū)分特異性和非特異性擴增，引物的設(shè)計和反應(yīng)條件的優(yōu)化對消除非特異性熒光有很大幫助。
2.Taqman探針：
也稱為水解寡核苷酸探針。該探針在5’端標記報告熒光基團，在3’端標記淬滅熒光基團，在探針完整時報告熒光基團發(fā)出的熒光被淬滅熒光基團吸收，因此沒有熒光產(chǎn)生。在延伸階段，由于DNA聚合酶具有5’－3’外切酶活性，5’端標記報告熒光基團被水解掉，遠離淬滅熒光基團，于是產(chǎn)生熒光信號。Taqman探針的優(yōu)點是可以利用多種熒光同時進行多重分析，這是SYBR等DNA結(jié)合熒光基團所不具備的優(yōu)點。
3.分子信標（molecular beacons）：
為一發(fā)夾結(jié)構(gòu)，環(huán)區(qū)與目的片段特異性互補，莖區(qū)的5’端和3’端分別標有熒光基團和淬滅基團。自由狀態(tài)的分子信標呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)，熒光基團和淬滅基團緊密接觸，能量以熱的形式消除，不產(chǎn)生熒光。退火時，發(fā)夾結(jié)果打開，環(huán)區(qū)與目的片段特異性互補結(jié)合，熒光基團和淬滅基團分開，釋放出熒光。分子信標優(yōu)于Taqman探針之處是可以檢測單個核苷酸的突變，適合于SNP分析和等位基因突變分析。缺點是設(shè)計比較困難，既要避免產(chǎn)生強的背景信號，又要避免莖部雜交過強，影響其與模板的退火，從而影響熒光的生成。
4.雜交探針：
是一種新型的熒光探針，由兩條探針組成，一條在5’端標記熒光（3’端被封閉，以防止退火后的延伸），一條在3’端標記熒光，其中一個為受體熒光基團，另一個為供體熒光基團，供體熒光基團的發(fā)射光譜覆蓋受體熒光基團的激發(fā)光譜，自由狀態(tài)時只能檢測到供體熒光基團發(fā)出的熒光。退火時兩條探針與目的基因特異性結(jié)合，形成首尾連接，兩個熒光基團互相靠近，供體基團發(fā)出的能量激發(fā)受體基團發(fā)出熒光，檢測時只檢測受體基團發(fā)出的熒光。只有當兩條探針均與目的基因特異性結(jié)合時，才能檢測到受體基團發(fā)出的熒光，因此檢測的特異性大大增加。
5.Scorpion引物/探針：
由一條發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探針和一條引物構(gòu)成，探針的5’端和3’端分別標有報告熒光和淬滅熒光，3’端通過一個非擴增的單體（防止探針退火后的延伸）與引物的5’端相連。在自由狀態(tài)，報告熒光和淬滅熒光很接近，不產(chǎn)生熒光。變性階段莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開，退火時引物與模板結(jié)合并延伸，環(huán)區(qū)與新合成的目的基因的互補區(qū)域結(jié)合，此時Scorpion探針與PCR產(chǎn)物在同一條DNA鏈上，是分子內(nèi)的結(jié)合。由于發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，報告熒光和淬滅熒光分離，因此可檢測到報告熒光發(fā)出的熒光信號。由于Scorpion引物/探針中序列特異性引物和探針在同一分子上，因此信號的產(chǎn)生特別快。
一種DNA結(jié)合染料，能非特異性地與雙鏈DNA結(jié)合，結(jié)合后發(fā)出熒光，價格便宜，但因無特異性，易受到非特異性擴增和引物二聚體地的影響，是定量結(jié)果不可靠。可用融解曲線分析區(qū)分特異性和非特異性擴增，引物的設(shè)計和反應(yīng)條件的優(yōu)化對消除非特異性熒光有很大幫助。
2.Taqman探針：
也稱為水解寡核苷酸探針。該探針在5’端標記報告熒光基團，在3’端標記淬滅熒光基團，在探針完整時報告熒光基團發(fā)出的熒光被淬滅熒光基團吸收，因此沒有熒光產(chǎn)生。在延伸階段，由于DNA聚合酶具有5’－3’外切酶活性，5’端標記報告熒光基團被水解掉，遠離淬滅熒光基團，于是產(chǎn)生熒光信號。Taqman探針的優(yōu)點是可以利用多種熒光同時進行多重分析，這是SYBR等DNA結(jié)合熒光基團所不具備的優(yōu)點。
3.分子信標（molecular beacons）：
為一發(fā)夾結(jié)構(gòu)，環(huán)區(qū)與目的片段特異性互補，莖區(qū)的5’端和3’端分別標有熒光基團和淬滅基團。自由狀態(tài)的分子信標呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)，熒光基團和淬滅基團緊密接觸，能量以熱的形式消除，不產(chǎn)生熒光。退火時，發(fā)夾結(jié)果打開，環(huán)區(qū)與目的片段特異性互補結(jié)合，熒光基團和淬滅基團分開，釋放出熒光。分子信標優(yōu)于Taqman探針之處是可以檢測單個核苷酸的突變，適合于SNP分析和等位基因突變分析。缺點是設(shè)計比較困難，既要避免產(chǎn)生強的背景信號，又要避免莖部雜交過強，影響其與模板的退火，從而影響熒光的生成。
4.雜交探針：
是一種新型的熒光探針，由兩條探針組成，一條在5’端標記熒光（3’端被封閉，以防止退火后的延伸），一條在3’端標記熒光，其中一個為受體熒光基團，另一個為供體熒光基團，供體熒光基團的發(fā)射光譜覆蓋受體熒光基團的激發(fā)光譜，自由狀態(tài)時只能檢測到供體熒光基團發(fā)出的熒光。退火時兩條探針與目的基因特異性結(jié)合，形成首尾連接，兩個熒光基團互相靠近，供體基團發(fā)出的能量激發(fā)受體基團發(fā)出熒光，檢測時只檢測受體基團發(fā)出的熒光。只有當兩條探針均與目的基因特異性結(jié)合時，才能檢測到受體基團發(fā)出的熒光，因此檢測的特異性大大增加。
5.Scorpion引物/探針：
由一條發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探針和一條引物構(gòu)成，探針的5’端和3’端分別標有報告熒光和淬滅熒光，3’端通過一個非擴增的單體（防止探針退火后的延伸）與引物的5’端相連。在自由狀態(tài)，報告熒光和淬滅熒光很接近，不產(chǎn)生熒光。變性階段莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開，退火時引物與模板結(jié)合并延伸，環(huán)區(qū)與新合成的目的基因的互補區(qū)域結(jié)合，此時Scorpion探針與PCR產(chǎn)物在同一條DNA鏈上，是分子內(nèi)的結(jié)合。由于發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，報告熒光和淬滅熒光分離，因此可檢測到報告熒光發(fā)出的熒光信號。由于Scorpion引物/探針中序列特異性引物和探針在同一分子上，因此信號的產(chǎn)生特別快。