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RT-PCR引物設(shè)計(jì)原則和方法
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在NCBI上搜索到該基因，找到該基因的mRNA，在CDS選項(xiàng)中，找到編碼區(qū)所在位置，在下面的origin中，Copy該編碼序列作為軟件查詢序列的候選對(duì)象。 打開Primer Premier5，點(diǎn)擊File-New-DNA sequence, 出現(xiàn)輸入序列窗口，Copy目的序列在輸入框內(nèi)（選擇As），此窗口內(nèi)，序列也可以直接翻譯成蛋白。點(diǎn)擊Primer，進(jìn)入引物窗口。 此窗口可以鏈接到“引物搜索”、“引物編輯”以及“搜索結(jié)果”選項(xiàng)，點(diǎn)擊Search按鈕，進(jìn)入引物搜索框，選擇“PCR primers”，“Pairs”，設(shè)定搜索區(qū)域和引物長(zhǎng)度和產(chǎn)物長(zhǎng)度。在Search Parameters里面，可以設(shè)定相應(yīng)參數(shù)。一般若無特殊需要，參數(shù)選擇默認(rèn)即可，但產(chǎn)物長(zhǎng)度可以適當(dāng)變化，因?yàn)?00～200bp的產(chǎn)物電泳跑得較散，所以可以選擇300～500bp。 點(diǎn)擊OK，軟件即開始自動(dòng)搜索引物，搜索完成后，會(huì)自動(dòng)跳出結(jié)果窗口，搜索結(jié)果默認(rèn)按照評(píng)分（Rating）排序，點(diǎn)擊其中任一個(gè)搜索結(jié)果，可以在“引物窗口”中，顯示出該引物的綜合情況，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各種信息等。 對(duì)于引物的序列，可以簡(jiǎn)單查看一下，避免出現(xiàn)下列情況：3’端不要以A結(jié)尾，最好是G或者C，T也可以；3’不要出現(xiàn)連續(xù)的3個(gè)堿基相連的情況，比如GGG或 CCC，否則容易引起錯(cuò)配。此窗口中需要著重查看的包括：Tm應(yīng)該在55～70度之間，GC％應(yīng)該在45％～55％間，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下較好。該窗口的最下面列出了兩條引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息，包括，發(fā)卡，二聚體，引物間交叉二聚體和錯(cuò)誤引發(fā)位置。若按鈕顯示為紅色，表示存在該二級(jí)結(jié)構(gòu)，點(diǎn)擊該紅色按鈕，即可看到相應(yīng)二級(jí)結(jié)構(gòu)位置圖示。最理想的引物，應(yīng)該都不存在這些二級(jí)結(jié)構(gòu)，即這幾個(gè)按鈕都顯示為“None”為好。但有時(shí)很難找到各個(gè)條件都滿足的引物，所以要求可以適當(dāng)放寬，比如引物存在錯(cuò)配的話，可以就具體情況考察該錯(cuò)配的效率如何，是否會(huì)明顯影響產(chǎn)物。對(duì)于引物具體詳細(xì)的評(píng)價(jià)需要借助于Oligo來完成，Oligo自身雖然帶有引物搜索功能，但其搜索出的引物質(zhì)量感覺不如Primer5。 在 Primer5窗口中，若覺得某一對(duì)引物合適，可以在搜索結(jié)果窗口中，點(diǎn)擊該引物，然后在菜單欄，選擇File-Print-Current pair，使用PDF虛擬打印機(jī)，即可轉(zhuǎn)換為Pdf文檔，里面有該引物的詳細(xì)信息。 在Oligo軟件界面，F(xiàn)ile菜單下，選擇 Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，該序列已經(jīng)被保存為Seq文件），會(huì)跳出來兩個(gè)窗口，分別為Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，點(diǎn)擊最左下角的按鈕，會(huì)出來引物定位對(duì)話框，輸入候選的上游引物序列位置（Primer5已經(jīng)給出）即可，而引物長(zhǎng)度可以通過點(diǎn)擊Change－Current oligo length來改變。定位后，點(diǎn)擊Tm窗口的Upper按鈕，確定上游引物，同樣方法定位下游引物位置，點(diǎn)擊Lower按鈕，確定下游引物。引物確定后，即可以充分利用Analyze菜單中各種強(qiáng)大的引物分析功能了。 Analyze中，第一項(xiàng)為Key info，點(diǎn)擊Selected primers，會(huì)給出兩條引物的概括性信息，其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearest neighbor method計(jì)算，會(huì)比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中還給出引物的Delta G和3’端的Delta G。3’端的Delta G過高，會(huì)在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引起DNA聚合反應(yīng)，因此此項(xiàng)絕對(duì)值應(yīng)該小一些，最好不要超過9。 Analyze中第二項(xiàng)為 Duplex Formation，即二聚體形成分析，可以選擇上游引物或下游引物，分析上游引物間二聚體形成情況和下游引物間的二聚體情況，還可以選擇 Upper/Lower，即上下游引物之間的二聚體形成情況。引物二聚體是影響PCR反應(yīng)異常的重要因素，因此應(yīng)該避免設(shè)計(jì)的引物存在二聚體，至少也要使設(shè)計(jì)的引物形成的二聚體是不穩(wěn)定的，即其Delta G值應(yīng)該偏低，一般不要使其超過4.5kcal/mol，結(jié)合堿基對(duì)不要超過3個(gè)。Oligo此項(xiàng)的分析窗口中分別給出了3’端和整個(gè)引物的二聚體圖示和 Delta G值。 Analyze中第三項(xiàng)為Hairpin Formation，即發(fā)夾結(jié)構(gòu)分析?？梢赃x擇上游或者下游引物，同樣，Delta G值不要超過4.5kcal/mol，堿基對(duì)不要超過3個(gè)。 Analyze 中第四項(xiàng)為Composition and Tm，會(huì)給出上游引物、下游引物和產(chǎn)物的各個(gè)堿基的組成比例和Tm值。上下游引物的GC％需要控制在40％～60％，而且上下游引物之間的GC％不要相差太大。Tm值共有3個(gè)，分別采用三種方法計(jì)算出來，包括nearest neighbor method、％GC method和2(A＋T)＋4(G＋C)method，最后一種應(yīng)該是Primer5所采用的方法，Tm值可以控制在50～70度之間。 第五項(xiàng)為False Priming Sites，即錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)，在Primer5中雖然也有False priming分析，但不如oligo詳細(xì)，并且oligo會(huì)給我正確引發(fā)效率和錯(cuò)誤引發(fā)效率，一般的原則要使錯(cuò)誤引發(fā)效率在100以下，當(dāng)然有時(shí)候正確位點(diǎn)的引發(fā)效率很高的話，比如達(dá)到400～500，錯(cuò)誤引發(fā)效率超過100幅度若不大的話，也可以接受。 Analyze中，有參考價(jià)值的最后一項(xiàng)是“PCR”，在此窗口中，是基于此對(duì)引物的PCR反應(yīng)Summary，并且給出了此反應(yīng)的最佳退火溫度，另外，提供了對(duì)于此對(duì)引物的簡(jiǎn)短評(píng)價(jià)。若該引物有不利于PCR反應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)存在，并且Delta G值偏大的話，Oligo在最后的評(píng)價(jià)中會(huì)注明，若沒有注明此項(xiàng)，表明二級(jí)結(jié)構(gòu)能值較小，基本可以接受。 引物評(píng)價(jià)完畢后，可以選擇 File－Print，打印為PDF文件保存，文件中將會(huì)包括所有Oligo軟件中已經(jīng)打開的窗口所包括的信息，多達(dá)數(shù)頁。因此，打印前最好關(guān)掉Tm窗口和Delta G窗口，可以保留引物信息窗口、二級(jí)結(jié)構(gòu)分析窗口（若存在可疑的異常的話）和PCR窗口。 引物確定后，對(duì)于上游和下游引物分別進(jìn)行Blast分析，一般來說，多少都會(huì)找到一些其他基因的同源序列，此時(shí)，可以對(duì)上游引物和下游引物的blast結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，只要沒有交叉的其他基因的同源序列就可以。 有一個(gè)問題，引物設(shè)計(jì)原則里面常常強(qiáng)調(diào)，引物所對(duì)應(yīng)模板序列的Tm 值最好在72℃左右，但是軟件里面Search出來的引物，很少有達(dá)到這個(gè)值的，一般都在50～65度之間，這是什么原因？軟件怎么沒有限定這個(gè)規(guī)則？ |