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總結(jié)了細(xì)菌、真菌 DNA 的提取方法
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細(xì)菌 DNA 的提?。?br />
方法一： 試劑： 1. 抽提緩沖液 2% CTAB (W/V)、2% PVP K25 (w/v)（去色素）、100 mM Tris-HCl (pH8.0)、25 mM EDTA (pH8.0)、2.0M NaCl 2.10M LiCl 3. 2M LiCl 4.DEPC-water（抑制 RNA 酶活性） 5. 3M NaAc (pH5.2) 6. 96% 乙醇 7. 70% 乙醇 步驟： 1. 抽提緩沖液 65℃ 預(yù)熱； 2. 加菌體到已經(jīng)預(yù)熱的緩沖液（700ul）中混勻，65℃，10 min； 3. 加酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），振蕩，離心 12,000rpm，10 min； 4. 取上清，加氯仿/異戊醇（24：1）振蕩，離心 12,000rpm，10 min； 5. 取上清，重復(fù) 4 步驟； 6. 加入 1/10 體積的 3M 醋酸鈉和 1.5 倍體積的乙醇（或加入等體積的異丙醇），－20C 沉淀； 11. 離心 12,000rpm，10 min； 12. 棄上清，70％ 乙醇洗，也可以再用 100％ 乙醇洗，然后溶解于 100 ml 水中。 方法二： 注意：我們常用的方法，但是有時(shí)有些細(xì)菌特別不好提，就用上面的方法。 1. 將菌株接種于液體 LB 培養(yǎng)基，37℃ 震蕩培養(yǎng)過夜。 2. 取 1.5 ml 培養(yǎng)物 12000rpm 離心 2 min。 3. 沉淀物加入 567 ul 的 TE 緩沖液，反復(fù)吹打使之重新懸浮，加入 30ul 10%SDS 和 15ul 的蛋白酶 K，混勻，于 37℃ 溫育 1 h. 4. 加入 100ul 5mol/L NaCl, 充分混勻，再加入 80ul CTAB/NaCl 溶液，混勻后再 65℃ 溫育 10 min。 5. 加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混勻，離心 4-5 min, 將上清轉(zhuǎn)入一只新管中，加入 0.6-0.8 倍體積的異丙醇，輕輕混合直到 DNA 沉淀下來，沉淀可稍加離心。 6. 沉淀用 1 ml 的 70% 乙醇洗滌后，離心棄乙醇． 真菌 DNA 的提?。?br /> 方法一： 1. 取真菌菌絲 0.5 g, 在液氮中迅速研磨成粉 2. 加入 4 mL 提取液，快速振蕩混勻 3. 加入等體積的 4 mL 的氯仿: 異戊醇 (24:1)，渦旋 3～5 min（此處是粗提沒有加酚，可以節(jié)約成本的喲?。?br /> 4.1000rpm，4℃，5 min 5. 上清用體積的氯仿: 異戊醇 (24:1) 再抽提一次（10,000 rpm，4℃ 離心 5 min） 6. 取上清，加入 2/3 倍體積的-20℃ 預(yù)冷異丙醇或 2.5 倍體積的無水乙醇沉淀, 混勻, 靜置約 30 min 7. 用毛細(xì)玻棒挑出絮狀沉淀, 用 75% 乙醇反復(fù)漂洗數(shù)次, 再用無水乙醇漂洗 1 次, 吹干，重懸于 500 mulTE 中 8. 加入 1 ul RNaseA（10 mg/mL），37℃ 處理 1 hr 9. 用酚（pH8.0）: 氯仿: 異戊醇 (25:24:1) 和氯仿: 異戊醇 (24:1) 各抽提 1 次（10,000 rpm，4℃ 離心 5 min） 10. 取上清，1/10V 3M NaAc,2.5V 體積的無水乙醇, -70℃ 沉淀 30 min 以上 11. 沉淀用 75% 乙醇漂洗，風(fēng)干, 溶于 200 ulTE 中，-20 ℃ 保存?zhèn)溆?br /> 12. DNA 提取液：0.2M Tris-HCl（pH 7.5），0.5M NaCl，0.01M EDTA，1％SDS， 3M NaAc 方法二： 1. 真菌菌絲 0.5-1 g, 在液氮中迅速研磨成粉 2. 加入 3 mL 65℃ 預(yù)熱的 DNA 提取緩沖液，快速振蕩混勻 65℃ 水浴 30 min, 期間混勻 2-3 次 3．加入 1 mL 5M KAc，冰浴 20 min 4．等體積的氯仿: 異戊醇 (24:1) 抽提 1 次（10,000 rpm，4℃ 離心 5 min） 5．取上清，加入 2/3 倍體積的-20℃ 預(yù)冷異丙醇, 混勻, 靜置約 30 min 6．用毛細(xì)玻棒挑出絮狀沉淀, 用 75% 乙醇反復(fù)漂洗數(shù)次, 再用無水乙醇漂洗 1 次, 吹干，重懸于 500 mL TE 中 7．加入 1 ul RNaseA（10 mg/mL），37℃ 處理 1 hr 8．用酚（pH8.0）: 氯仿: 異戊醇 (25:24:1) 和氯仿: 異戊醇 (24:1) 各抽提 1 次（10,000 rpm，4℃ 離心 5 min） 9．取上清，1/10V 3M NaAc,2.5V 體積的無水乙醇, -70℃ 沉淀 30 min 以上 10．沉淀用 75% 乙醇漂洗，風(fēng)干, 溶于 200 ul TE 中，-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?br /> 以上就是一些實(shí)驗(yàn)室常用的方法 |