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SURE Chemically Competent Cell 產(chǎn)品說明書  

產(chǎn)品規(guī)格

SURE:                                                          10×100μl

pUC19(control vector):  10pg/μl                       10μl

保存條件：-80℃ 

基因型

E. coli B e14^-(mcrA^-) Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)171 endA1 gyrA96 thi-1 supE44 relA1 lac recB recJ sbcC umuC::Tn5 (Kan^r) uvrC [F′ proAB lacI^qZΔM15 Tn10 (Tet^r)]

產(chǎn)品說明

真核生物DNA存在較多“十字型”、“Z字型”等二級或三級結(jié)構(gòu)，這種DNA結(jié)構(gòu)在利用傳統(tǒng)大腸桿菌進(jìn)行克隆時易被大腸桿菌體內(nèi)的重組酶系統(tǒng)或其他防御系統(tǒng)識別并對其進(jìn)行重組，刪除等破壞，導(dǎo)致很難對這類DNA進(jìn)行正確的克隆操作。SURE菌株可以解決這些問題：此菌株體內(nèi)重組酶系統(tǒng)整條通路被破壞，并且 (McrA-, McrCB-, McrF-, Mrr-, HsdR-)這些限制性突變的存在賦予此菌株無法對外源DNA進(jìn)行標(biāo)記、限制，提高了外源甲基化DNA的克隆效率，同時具有核酸酶 (endA)突變、重組酶 (recB recJ)突變，增強了外源DNA的穩(wěn)定性。存在于F′因子上的lacIqZΔM15基因使此菌株可以進(jìn)行藍(lán)白斑篩選；Kan^r，Tet^r賦予菌株卡那霉素和四環(huán)素抗性。SURE感受態(tài)細(xì)胞由特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率達(dá)5×10⁸ cfu/μg DNA。

常規(guī)操作方法

1. SURE感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA (質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物) 并用手撥打EP管底輕輕混勻 (避免用槍吸打)，冰中靜置25分鐘。

2. 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動會降低轉(zhuǎn)化效率。

3. 向離心管中加入700μl不含抗生素的無菌培養(yǎng)基 (2YT或LB)，混勻后37℃，200rpm復(fù)蘇60分鐘。

4. 5000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。

5. 將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

Stratagene standard protocol

1. Pre-chill a 14-ml BD Falcon polypropylene round-bottom tubes on ice. Preheat NZY+ broth to 42℃.

2. Thaw the cells on ice. When thawed, gently mix and aliquot 100 μl of cells into the pre-chilled tubes.

3. Add 4 μl of the β-ME (β巰基乙醇) to the aliquot of cells.

4. Swirl the tubes gently. Incubate the cells on ice for 10 minutes, swirling gently every 2 minutes.

5. Add 0.1-50 ng of the experimental DNA (or 2 μl of a ligation mixture) to the aliquot of cells.

6. Swirl the tubes gently, then incubate the tubes on ice for 30 minutes.

7. Heat-pulse the tubes in a 42℃ water bath for 30 seconds. The duration of the heat pulse is critical.

8. Incubate the tubes on ice for 2 minutes.

9. Add 0.9 ml of preheated (42℃) NZY+ broth and incubate the tubes at 37℃ for 1 hour with shaking at 225-250 rpm.

10. Plate ≤200 μl of the transformation mixture on LB agar plates containing the appropriate antibiotic (and containing IPTG and X-gal if color screening is desired).

11. Incubate the plates at 37℃ overnight. If performing blue-white color screening, incubate the plates at 37℃for at least 17 hours to allow color development (color can be enhanced by subsequent incubation of the plates for 2 hours at 4℃).

注意事項

1. 感受態(tài)細(xì)胞最好在冰中緩慢融化，插入冰中8分鐘內(nèi)加入目標(biāo)DNA，不可在冰中放置時間過長，長時間存放會降低轉(zhuǎn)化效率。

2. 混入質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物時應(yīng)輕柔操作。

3. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?；蚋咝实倪B接產(chǎn)物可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。

4. 此菌株具有卡那霉素，四環(huán)素抗性，擁有這兩種抗性的質(zhì)粒無法使用；對<40 μg/ml氯霉素有抗性，但對100 μg/ml氯霉素敏感。使用其他抗生素參考濃度：氨芐青霉素 (終濃度: 100 μg/ml），氯霉素 (終濃度: 100 μg/ml)。

5.SURE感受態(tài)細(xì)胞采用常規(guī)轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)5×10⁸ cfu/μg DNA。如果有更高要求，可嘗試Stratagene公司推薦的標(biāo)準(zhǔn)protocol。