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EHA105 Electroporation-Competent Cell 產(chǎn)品說明書
產(chǎn)品規(guī)格
EHA105： 10×50μl
pCAMBIA2301 (control vector) 10ng/μl 10μl
保存條件： -80℃
基因型
C58 (rif r) Ti pEHA105 (pTiBo542DT-DNA) Succinamopine
產(chǎn)品說明
EHA105菌株由EHA101菌株改造而來，為C58型背景，核基因中含有篩選標(biāo)簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉(zhuǎn)化操作，此菌株攜帶一無自身轉(zhuǎn)運(yùn)功能的琥珀堿型Ti質(zhì)粒pEHA105 (pTiBo542DT-DNA)，此質(zhì)粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pEHA105 (pTiBo542DT-DNA)質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移)。EHA105菌株適用于水稻、煙草等植物的轉(zhuǎn)基因操作。唯地生物開發(fā)的EHA105電轉(zhuǎn)感受態(tài)特別適用于大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：經(jīng)pCAMBIA2301質(zhì)粒 (size:11633 bp)檢測轉(zhuǎn)化效率>105 cfu/μg DNA；經(jīng)pCAMBIA2301-ZH質(zhì)粒（size:40 kd）檢測轉(zhuǎn)化效率可達(dá)5×103 cfu/μg DNA。
操作方法
1. 0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，使乙醇充分揮發(fā)，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實(shí)冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。
2. 取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)插入冰中5分鐘，待其融化，加入1-5 μg質(zhì)粒DNA（質(zhì)粒體積不大于6ul，最好用試劑盒抽提，雙蒸水溶解），用手撥打管底混勻，立即插入冰中，用200 μl槍頭將感受態(tài)-質(zhì)?；旌衔锟焖僖频诫姄舯校w上杯蓋，空管保留待用。
3. 啟動電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置參數(shù)：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此參數(shù)為Biorad 推薦，使用者也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的protocol操作），將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中，電擊完成快速插入冰中，加入700 μl無抗生素的LB并轉(zhuǎn)移到感受態(tài)空管中，28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時。
4. 6000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天
（當(dāng)平板只含有50 μg/ml kan 時，28℃培養(yǎng)48 h即可；平板中同時加入50 μg/ml kan，20 μg/ml rif 時，需28℃培養(yǎng)60 h；如果使用的平板含有50 μg/ml rif 則需要28℃培養(yǎng)72-90 h）。
備注
1、農(nóng)桿菌相關(guān)抗生素配方：
|
抗生素 |
配方 |
原液 |
工作液 |
|
羧芐青霉素（carb） |
雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌 |
50 mg/ml |
50 μg/ml |
|
硫酸卡那霉素（kan） |
雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌 |
50 mg/ml |
50 μg/ml |
|
鏈霉素（strep） |
雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌 |
10 mg/ml |
50 μg/ml |
|
利福平（rif） |
DMSO溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌 |
10 mg/ml |
20 μg/ml |
|
慶大霉素（gent） |
雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌 |
20 mg/ml |
40 μg/ml |
2、常用農(nóng)桿菌抗性：（R：抗；S：敏感。）
|
農(nóng)桿菌菌株 |
羧芐青霉素(carb) |
鏈霉素(strep) |
利福平(rif) |
慶大霉素(gent) |
硫酸卡那霉素(kan) |
|
AGL-1 |
R |
S |
R |
S |
S |
|
EHA101 |
S |
S |
R |
S |
R |
|
EHA105 |
S |
S |
R |
S |
S |
|
LBA4404 |
S |
R |
R |
S |
S |
|
GV3101 |
S |
S |
R |
R |
S |
3、LB及YEB配方：
|
component |
LB(液體)/L |
LB(固體)/L |
component |
YEB(液體)/L |
YEB(固體)/L |
|
Tryptone |
10 g |
10 g |
Tryptone |
5 g |
5 g |
|
Yeast extract |
5 g |
5 g |
Yeast extract |
1 g |
1 g |
|
NaCl |
10 g |
10 g |
牛肉浸膏 |
5 g |
5 g |
|
NaOH |
調(diào)PH到7.0 |
調(diào)PH到7.0 |
蔗糖 |
5 g |
5 g |
|
Agar |
－ |
15 g |
MgSO4*7H2O |
0.49 g |
0.49 g |
|
|
|
|
NaOH |
調(diào)PH到7.0 |
調(diào)PH到7.0 |
|
|
|
|
Agar |
－ |
15 g |
注意事項(xiàng)
1. 加入質(zhì)粒時體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機(jī)物污染，轉(zhuǎn)化效率急劇下降；質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個數(shù)量級。
2. 混入質(zhì)粒時應(yīng)輕柔操作。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。
3. 平板上陽性克隆密度過大時，由于營養(yǎng)不足，陽性克隆生長變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應(yīng)減少質(zhì)粒用量。
4. 利福平濃度不應(yīng)高于25 μg/ml，過高的利福平濃度不利于農(nóng)桿菌生長，會降低其生長速度和轉(zhuǎn)化效率。本公司感受態(tài)計算轉(zhuǎn)化效率時所用平板只含有50 μg/ml kan，若所用平板含有20 μg/ml rif則轉(zhuǎn)化效率降低到1/2。
5. 培養(yǎng)基中加入利福平的目的是防止雜菌生長、篩選農(nóng)桿菌；根據(jù)所用菌株抗性加入Ti質(zhì)粒篩選抗生素可防止Ti質(zhì)粒丟失，但Ti質(zhì)粒篩選抗生素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作，所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時不考慮這些抗生素，Ti質(zhì)粒丟失的概率極低(可以忽略)。