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一、試劑盒組成、儲(chǔ)存、穩(wěn)定性 試劑盒組成 保存 50 次 （DP7101） 100 次 （DP7102） 緩沖液 VB 室溫 30 ml 60 ml 結(jié)合液 CB 室溫 30 ml 60 ml 抑制物去除液 IR 室溫 25 ml 50 ml 漂洗液 WB 室溫 15 ml 25 ml 第一次使用前請(qǐng)加入指定量乙醇 洗脫緩沖液 EB 室溫 15 ml 15 ml 蛋白酶 K （僅 II 型提供） -20℃ 20mg 凍干粉 2x20mg 凍干粉 微量吸附柱 室溫 50 100 個(gè) 收集管（2ml） 室溫 50 100 個(gè) 本試劑盒在室溫儲(chǔ)存 12 個(gè)月不影響使用效果。 注意: 1． 第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液 WB 中加入指定量乙醇,充分混勻，加入后請(qǐng)及時(shí)在方框 打鉤標(biāo)記已加入乙醇，以免多次加入! 2． 結(jié)合液 CB 或者抑制物去除液 IR 低溫時(shí)可能出現(xiàn)析出和沉淀，可以在 37℃水浴 幾分鐘幫助重新溶解，恢復(fù)澄清透明后冷卻到室溫即可使用。 3． 為避免降低活性，方便運(yùn)輸，提供蛋白酶 K 為凍干粉狀，收到后，可短暫離心后， 加入 400 微升或者 1 毫升滅菌水溶解(20mg/ml 終濃度)。因?yàn)榉磸?fù)凍融可能會(huì)降低酶 活性，因此溶解后立即按照每次使用量(20 微升)分裝凍存，-20℃保存。 4． 避免試劑長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中發(fā)生揮發(fā)、氧化、PH 值變化，各溶液使用后應(yīng)及時(shí)蓋 緊蓋子。  二、原理簡(jiǎn)介 獨(dú)特的結(jié)合液/蛋白酶 K 迅速裂解細(xì)胞和滅活細(xì)胞內(nèi)核酸酶，然后基因組 DNA 在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜， 再通過(guò)一系列快 速的漂洗－離心的步驟, 抑制物去除液和漂洗液將細(xì)胞代謝物、蛋白等雜質(zhì) 去除， 最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組 DNA 從硅基質(zhì)膜上洗脫。 三、試劑盒特點(diǎn) 1． 不需要使用有毒的苯酚等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。 2． 快速，簡(jiǎn)捷，單個(gè)樣品操作一般可在 30 分鐘內(nèi)完成。 3． 多次柱漂洗確保高純度,無(wú)抑制性雜質(zhì)。 4． 本試劑盒用于從新鮮或者冷凍骨頭樣品中提取基因組 DNA。所得樣 品可以直接用于 PCR、酶切、雜交等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。 四、注意事項(xiàng)（實(shí)驗(yàn)前必須首先閱讀這部分?。? 1． 所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13，000 rpm的傳 統(tǒng)臺(tái)式離心機(jī)，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機(jī)。 2． 開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前將需要的水浴先預(yù)熱到 70℃?zhèn)溆谩? 3． 為了保證樣本不被食物或飲料污染，取樣前 30 分鐘內(nèi)請(qǐng)勿進(jìn)食和 飲水。 五、操作步驟 * 第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液 WB 中加入指定量無(wú)水乙醇! 1. 處理材料：將適量骨頭或軟骨用液氮或破碎儀研成粉末， 轉(zhuǎn)置于 2ml 離心管中， 加入 400μl 緩沖液 VB。 注意：如果需要去除 RNA，可加入 4μlRNaseA（100mg/ml）溶液（客戶自備， 目錄號(hào)：sp1001），振蕩 15 秒，室溫放置 5 分鐘。 2. 加入 20μl 蛋白酶 K 溶液，渦旋 10 秒混勻，65℃放置 10 分鐘，其間每 2 分鐘渦旋 混勻數(shù)次。 3. 13000rpm 離心取上清，轉(zhuǎn)入新的 1.5ml 離心管中，加入 400μl 結(jié)合液 CB，充分顛 倒混勻，70℃放置 10 分鐘，此時(shí)溶液應(yīng)變清亮，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的液 滴。 注意 1: 加入緩沖液時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生白色沉淀，一般 70℃放置時(shí)會(huì)消失，不會(huì)影 響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如溶液未變清亮，說(shuō)明細(xì)胞裂解不徹底，可能導(dǎo)致提取量少和提 取出的不純。 ,4. 加 200μl 無(wú)水乙醇，充分顛倒混勻，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的液滴。 注意：加入無(wú)水乙醇后可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，但不影響 DNA 提取。 5. 將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)微量吸附柱中（微量吸附柱放入收集管 中），12000rpm 離心 30 秒，倒掉收集管中的廢液，將微量吸附柱放回收集管中。 6. 向微量吸附柱中加入 500μl 抑制物去除液 IR，12000 rpm 離心 30 秒，倒掉收集管中 的廢液，將微量吸附柱放入收集管中。  7. 向微量吸附柱中加入 700μl 漂洗液 WB（使用前請(qǐng)先檢查是否加入無(wú)水乙醇），12000 rpm 離心 30 秒，倒掉收集管中的廢液，將微量吸附柱放回收集管。 8. 向微量吸附柱中加入 500μl 漂洗液 WB，12000 rpm 離心 30 秒，倒掉收集管中的廢 液。 9. 將微量吸附柱放回收集管中，12000rpm 離心 2 分鐘，倒掉廢液。將微量吸附柱室 溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。 注意：這一步的目的是將微量吸附柱中殘余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的殘留會(huì) 影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切等）實(shí)驗(yàn)。 10. 將微量吸附柱轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加 20-50μl 洗脫 緩沖液 EB(洗脫緩沖液 EB 事先在 65-70℃預(yù)熱)，室溫放置 2-5 分鐘，12000rpm 離 心 2 分鐘。 注意：洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于 20ul，體積過(guò)小影響回收效率。 為增加基因組的得率，可將離心得到的溶液再加入微量吸附柱中，室溫放置 2 分 鐘，12000rpm 離心 2 分鐘。 洗脫液的對(duì)于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應(yīng)保證其 PH 值在 7.0-8.5 范 圍內(nèi)（可以用將水的值調(diào)到此范圍），PH 值低于 7.0 會(huì)降低洗脫效率；且 DNA 產(chǎn)物應(yīng)保持在-20℃，以防 DNA 降解。