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一、 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序概述

轉(zhuǎn)錄組是特定物種、組織或細(xì)胞類型轉(zhuǎn)錄的所有RNA（轉(zhuǎn)錄本）的集合，包括mRNA和非編碼RNA(Non-coding RNA， 非編碼RNA又包括：tRNA，rRNA，snoRNA，microRNA，piRNA，lncRNA等。通過(guò)比較轉(zhuǎn)錄組或基因表達(dá)譜的研究以揭示生物學(xué)現(xiàn)象或疾病發(fā)生的分子機(jī)制是高通量組學(xué)研究的一個(gè)常用策略。利用高通量測(cè)序技術(shù)研究轉(zhuǎn)錄組在全面快速得到基因表達(dá)譜變化的同時(shí)，還可以通過(guò)測(cè)定的序列信息精確地分析轉(zhuǎn)錄本的cSNP（編碼序列單核苷酸多態(tài)性）、可變剪接等序列及結(jié)構(gòu)變異，另外對(duì)于檢測(cè)低豐度轉(zhuǎn)錄本和發(fā)現(xiàn)新轉(zhuǎn)錄本具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

二、 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)優(yōu)勢(shì)

1. 直接得到核酸序列信息，除了得到基因表達(dá)量的差異，更可以檢測(cè)RNA的結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)變異。
2. 開(kāi)放性的轉(zhuǎn)錄組分析：無(wú)需參考基因組信息，無(wú)需設(shè)計(jì)探針，不但能檢測(cè)已知基因還能夠發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本。
3. 在測(cè)序覆蓋率足夠大時(shí)能夠檢測(cè)到細(xì)胞中的低豐度轉(zhuǎn)錄本。
4. 隨著測(cè)序深度的增加可以獲得更廣的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍，能夠同時(shí)鑒定和定量高豐度轉(zhuǎn)錄本和低豐度轉(zhuǎn)錄本。

三、研究?jī)?nèi)容

基因表達(dá)水平研究：基因表達(dá)是將基因中蘊(yùn)含的遺傳信息通過(guò)轉(zhuǎn)錄、剪接、翻譯等轉(zhuǎn)變成功能產(chǎn)物的所有加工過(guò)程，是生物生命活動(dòng)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。基因從DNA 轉(zhuǎn)錄成RNA 是基因表達(dá)的首要步驟。基因轉(zhuǎn)錄形成的RNA 豐度不同很大程度地影響到基因最終功能產(chǎn)物的分子濃度。因此，檢測(cè)基因在RNA水平的表達(dá)量即基因轉(zhuǎn)錄得到的RNA 的豐度成為人們研究基因表達(dá)的關(guān)鍵方法。

研究流程示例

 

轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)變異研究：利用單堿基分辨率的RNA-Seq 技術(shù)可極大地豐富基因注釋的很多方面, 包括5′/3′邊界鑒定、UTRs區(qū)域鑒定以及新的轉(zhuǎn)錄區(qū)域鑒定等。在發(fā)現(xiàn)序列差異(如融合基因鑒定、編碼序列多態(tài)性研究)方面, RNA-Seq 也展示了其很大的潛力。

研究流程示例

四、 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)嶒?yàn)技術(shù)路線

 

樣品要求（RNA）
樣品純度：OD 260/280值應(yīng)在1.9～2.2 之間，RNA 28S:18S≥1.5，推薦 RIN≥7；DNA 應(yīng)該去除干凈。
樣品濃度：最低濃度不低于100ng/μl。
樣品總量：每個(gè)樣品總量不少于7μg。
樣品溶劑：要溶解在H20或TE (pH 8.0)中。
樣品運(yùn)輸： RNA用凍存管保存，并用干冰或液氮運(yùn)輸。

數(shù)據(jù)分析技術(shù)路線及數(shù)據(jù)分析內(nèi)容（無(wú)參考基因組）

 

 

1. 數(shù)據(jù)預(yù)處理
目的：對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行一定程度的過(guò)濾。
原理：根據(jù)測(cè)序接頭以及測(cè)序質(zhì)量對(duì)原始的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，其中，測(cè)序質(zhì)量Q與測(cè)序錯(cuò)誤E之間的關(guān)系如下：

 結(jié)果：對(duì)預(yù)處理后質(zhì)量以及堿基分布統(tǒng)計(jì)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)

2. UniGene拼接
目的：將預(yù)處理后reads進(jìn)行拼接，得到拼接結(jié)果。
原理： 應(yīng)用 de Bruijn graph path 算法對(duì)reads進(jìn)行de novo拼接；對(duì)上一步的拼接結(jié)果，再用Hamilton Path算法拼接。
結(jié)果：UniGene序列，UniGene統(tǒng)計(jì)信息，序列長(zhǎng)度分布圖

3. 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋
目的：對(duì)拼接得到的UniGene進(jìn)行功能注釋
原理：通過(guò)blast+算法將拼接得到的UniGene序列與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)
結(jié)果：比對(duì)結(jié)果表格，物種分布統(tǒng)計(jì)和Evalue分布統(tǒng)計(jì)

4. UniGene表達(dá)分析
目的：UniGene定量分析。
原理：以UniGene為reference，分別將每個(gè)樣本的reads進(jìn)行reference mapping ,從而得到每個(gè)樣本在每個(gè)UniGenes中的一個(gè)reads覆蓋度，然后應(yīng)用RPKM/FPKM標(biāo)準(zhǔn)化公式對(duì)富集片段的數(shù)量進(jìn)行歸一化。

 

UniGene表達(dá)分布圖，1X，5X分別為FPKM=1，FPKM=5分界點(diǎn)，可以大體觀察到低表達(dá)，中表達(dá)以及高表達(dá)的比例關(guān)系

UniGene樣本間表達(dá)相關(guān)性散點(diǎn)圖    樣本間表達(dá)差異程度的MA圖，可以體現(xiàn)差異表達(dá)總體偏差

5. UniGene表達(dá)差異分析
目的：對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)分析，找出差異表達(dá)UniGene 
原理：雙層過(guò)濾篩選差異基因
FC值篩選：采用Fold-change(FC)，表達(dá)差異倍數(shù)進(jìn)行第一層此的差異基因篩選
FDR檢驗(yàn)：一般采用卡方檢驗(yàn)中的fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行p值檢驗(yàn)，采用Benjamini FDR(False discovery ratio)校驗(yàn)方法對(duì)p值進(jìn)行假陽(yáng)性檢驗(yàn)，即，通過(guò)FDR顯著性參數(shù)進(jìn)行第二層次的差異基因篩選。
結(jié)果展示：

 

6. GO功能分類
目的：利用數(shù)據(jù)庫(kù)注釋信息將 UniGene進(jìn)行 GO 功能分類。
原理：利用數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋結(jié)果，應(yīng)用blast2GO算法進(jìn)行GO功能分類，得到所有序列在Gene Ontology 的三大類：molecular function, cellular component, biological process 的各個(gè)層次所占數(shù)目，一般取到14層。
結(jié)果：MF，BP，CC三大分類結(jié)果文件以及 UniGene2GO 關(guān)系列表，三大類別中第二層次上的柱狀分布圖和餅圖，GO功能的層次分布圖。

 

7. KEGG代謝通路分析
目的：對(duì)拼接得到 UniGene 進(jìn)行 KEGG pathway 映射。
原理：應(yīng)用KEGG KAAS在線 pathway比對(duì)分析工具對(duì)拼接得到的UniGene進(jìn)行KEGG映射分析。
結(jié)果：標(biāo)記的Pathway通路圖。

8. COG注釋
目的：對(duì)拼接得到 UniGene 進(jìn)行 COG功能分類。
原理：利用blast+算法將拼接得到的UniGene與CDD庫(kù)中的COG/KOG庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行COG功能分類預(yù)測(cè)，將其映射到COG分類中。
結(jié)果： COG分類分布情況圖。

9. SSR重復(fù)序列注釋
目的：對(duì)拼接得到 UniGene進(jìn)行 SSR 簡(jiǎn)單重復(fù)序列的查找。
原理：篩選標(biāo)準(zhǔn)：?jiǎn)魏塑账嶂貜?fù)的次數(shù)在10次或10次以上，二核苷酸重復(fù)的次數(shù)在 6次或6次以上，三至六核苷酸重復(fù)的次數(shù)在 5次或 5次以上。同時(shí)，也篩選中間被少數(shù)堿基 (間隔小于100或等于100)打斷的不完全重復(fù)的SSR。
結(jié)果：重復(fù)序列的信息文件以及統(tǒng)計(jì)文件。

10. LncRNA預(yù)測(cè)
目的：對(duì)拼接得到的UniGene進(jìn)行LncRNA(Long noncoding RNA)預(yù)測(cè)。
原理： 通過(guò)以下過(guò)程對(duì)UniGene進(jìn)行過(guò)濾，最終得到候選LncRNA序列。
1) Unigene length > 200bp；
2) Unigene ORF(Open Reading Frame) length < 300；
3) 將滿足長(zhǎng)度條件的UniGene與多個(gè)近源物種進(jìn)行進(jìn)化分析，得到序列的保守性和進(jìn)化特性；
4) 根據(jù)上述的特性和已知數(shù)據(jù)庫(kù)中coding、noncoding區(qū)域的特性建立編碼篩選模型；
5) 將符合noncoding模型的UniGene與Pfam等蛋白域數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)，進(jìn)一步去除可能的編碼特性，最終得出LncRNA預(yù)測(cè)結(jié)果。

數(shù)據(jù)分析技術(shù)路線及數(shù)據(jù)分析內(nèi)容（有參考基因組）

1. 數(shù)據(jù)預(yù)處理
目的：對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行一定程度的過(guò)濾。
原理：根據(jù)測(cè)序接頭以及測(cè)序質(zhì)量對(duì)原始的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，其中，測(cè)序質(zhì)量Q與測(cè)序錯(cuò)
誤E之間的關(guān)系如下：

2. 比對(duì)基因組
目的：將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組進(jìn)行相似性比對(duì)。
原理：Burrower-Wheeler轉(zhuǎn)換算法與splicing比對(duì)算法。
1）Burrower-Wheeler轉(zhuǎn)換算法：由于測(cè)序數(shù)據(jù)量非常大，與整條基因組比對(duì)所需資源與時(shí)間是較為巨大的。目前，我們采用Burrower-Wheeler(BWT)算法對(duì)基因進(jìn)行建立索引、堿基壓縮等過(guò)程，這樣可以很大程度上加快比對(duì)速度，減少比對(duì)過(guò)程中所需資源。
2）splicing比對(duì)算法：即分段比對(duì)算法，當(dāng)某條測(cè)序序列位于轉(zhuǎn)錄本剪切位點(diǎn)時(shí)，也就是這條序列同時(shí)屬于兩個(gè)外顯子，如果將它與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，由于基因組兩個(gè)外顯子之間含有intron區(qū)，那么它將無(wú)法找到它合適的位置；但是應(yīng)用分段比對(duì)算法就可以將這條測(cè)序序列分割變成多段子序列，然后應(yīng)用這些段子序列與基因組進(jìn)行比對(duì)，這樣就可以找到它們真正的位置。

 

3. 基因表達(dá)水平研究
目的：應(yīng)用基因組比對(duì)結(jié)果進(jìn)行基因定量。
原理：從指定物種基因模型(基因結(jié)構(gòu))中得到gene、exon、intron以及UTR等位置信息，通過(guò)
基因組比對(duì)結(jié)果計(jì)算出在不用區(qū)域富集片段數(shù)目，然后應(yīng)用RPKM/FPKM標(biāo)準(zhǔn)化公式對(duì)富集片
段的數(shù)量進(jìn)行歸一化。

 

4. 差異表達(dá)分析
目的：應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)基因在樣本間的表達(dá)差異進(jìn)行分析。
原理：雙層過(guò)濾篩選差異基因。
FC值篩選：采用Fold-change(FC)，表達(dá)差異倍數(shù)進(jìn)行第一層此的差異基因篩選。
FDR檢驗(yàn)：一般采用卡方檢驗(yàn)中的fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行p值檢驗(yàn)，采用Benjamini FDR(False discovery ratio)校驗(yàn)方法對(duì)p值進(jìn)行假陽(yáng)性檢驗(yàn)，即，通過(guò)FDR顯著性參數(shù)進(jìn)行第二層次的差異基因篩選。
結(jié)果展示：

 

5. 轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)分析
目的：偵測(cè)不同類型的可變剪切事件。
原理：通過(guò)測(cè)序序列的splicing事件來(lái)偵測(cè)可能發(fā)生剪切連接的候選exon，通過(guò)已有可變剪切方式進(jìn)行驗(yàn)證，最終得出真實(shí)的可變剪切事件。
結(jié)果展示：對(duì)常見(jiàn)的可變剪切方式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

6. 新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測(cè)
目的：預(yù)測(cè)antisense transcript以及intron transcript。
原理：通過(guò)測(cè)序序列在基因組上富集的方向性進(jìn)行反義轉(zhuǎn)錄本預(yù)測(cè)，如果有富集區(qū)域方向與基
因轉(zhuǎn)錄本方向相反且達(dá)到一定的富集閾值，即可認(rèn)為其為antisense transcript。將完全位于
intron區(qū)的一段富集片段作為intron transcript。

7. 新基因預(yù)測(cè)
目的：預(yù)測(cè)intergenic區(qū)可能存在的新基因并對(duì)新基因進(jìn)行功能注釋。
原理：首先，得到在基因間區(qū)有測(cè)序序列富集的一些段區(qū)域；然后，排除那些已經(jīng)有注釋的那些段區(qū)域作為候選的新基因。

結(jié)果展示：

8. 基因融合分析
目的：尋找可能發(fā)生融合功能的基因
原理：通過(guò)測(cè)序片段的splicing事件以及pair-end測(cè)序的距離信息進(jìn)行基因融合位點(diǎn)的定位，
如果一個(gè)測(cè)序片段的一個(gè)子片段與geneA匹配，另一子片段與geneB匹配，那么geneA與geneB有可能為一個(gè)融合基因，而當(dāng)pair-end雙向測(cè)序時(shí)，一對(duì)測(cè)序片段中一個(gè)與geneA匹配，另一個(gè)與geneB匹配，那么geneA與geneB有可能為一個(gè)融合基因。如果同時(shí)滿足兩個(gè)條件，那么融合發(fā)生的可能性就較大。結(jié)果展示見(jiàn)右圖。

9. GO富集分析
目的：對(duì)差異基因相關(guān)GO功能進(jìn)行富集分析。

 

顯著富集GO功能圖形統(tǒng)計(jì)

10. KEGG富集分析
目的：對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG通路富集分析。
原理：應(yīng)用物種自己的KEGG pathway進(jìn)行富集分析，富集結(jié)果更加貼近物種現(xiàn)實(shí)功能實(shí)現(xiàn)的通路，尤其對(duì)目前功能注釋尚不完全的物種，如，大豆、玉米、葡萄、楊樹(shù)、白菜、牛、羊等物種的KEGG通路分析。

11. cSNV查找

目的：在轉(zhuǎn)錄水平找出變異位點(diǎn)或者片段。
原理：通過(guò)測(cè)序數(shù)據(jù)得到基因組每個(gè)位點(diǎn)的堿基富集情況；然后，統(tǒng)計(jì)每個(gè)點(diǎn)富集富集的堿基
種類，得出可能存在的變異(即，與參考基因組堿基不同且富集程度較高的堿基類別)。
結(jié)果展示：

12. LncRNA預(yù)測(cè)
目的：對(duì)新轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行LncRNA(Long noncoding RNA) 預(yù)測(cè)。
原理：通過(guò)以下過(guò)程對(duì)新轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行過(guò)濾，最終得到候選LncRNA序列：
1) 通過(guò)基因組比對(duì)得到4類新轉(zhuǎn)錄本：Intergenic transcript、Full intron transcript、Antisense transcript、Overlapped with known transcript，將這些新轉(zhuǎn)錄本用于LncRNA預(yù)測(cè)；
2) New Transcript length > 200bp；
3) New Transcript ORF(Open Reading Frame) length < 300；
4) 將滿足長(zhǎng)度條件的New Transcript與多個(gè)近源物種進(jìn)行進(jìn)化分析，得到序列的保守性和進(jìn)化關(guān)系；
5) 根據(jù)上述的特性以及已知數(shù)據(jù)庫(kù)中coding、noncoding區(qū)域的特性建立編碼篩選模型；
6) 將符合noncoding模型的New Transcript與Pfam等蛋白域數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)，進(jìn)一步去除可能的編碼特性，最終得出LncRNA預(yù)測(cè)結(jié)果。

13. LncRNA保守度分析
1) lncRNA 序列保守性分析lncRNA 序列保守性分析
基于multiple genome alignment進(jìn)行序列保守性分析。lncRNA的序列保守性用其序列比對(duì)的identity來(lái)表示。

2) lncRNA結(jié)構(gòu)保守性分析
通過(guò)使用RNAz軟件，推斷基于多序列比對(duì)的一致結(jié)構(gòu)，比較二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能與一致結(jié)構(gòu)的自由能，得到每一段aligned region 的SCI 值，并以此作為二級(jí)結(jié)構(gòu)的表征，SCI 越大則結(jié)構(gòu)越保守。

3) LncRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
根據(jù)lncRNA的序列保守性，使用RNAalifold軟件，可以同時(shí)看到其序列比對(duì)結(jié)果和保守的二級(jí)結(jié)構(gòu)。