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Stable Electroporation-Competent Cell產品說明書

產品規(guī)格

基因型

F' proA+B+ lacI^q ?(lacZ)M15 zzf::Tn10 (Tet^R) ?(ara-leu) 7697 araD139 fhuA ?lacX74 galK16 galE15 e14-Φ80dlacZ?M15 recA1 relA1 endA1 nupG rpsL (Str^R) rph spoT1 ?(mrr-hsdRMS -mcrBC)

產品說明

Stable電擊感受態(tài)細胞只能用于電擊轉化，不可用于熱激轉化。Stable菌株是NEB公司開發(fā)的高轉化效率菌株，是逆轉錄病毒/慢病毒載體系統(tǒng)推薦使用的菌株，具有與Stbl2，Stbl3完全不同的基因型，但是表現(xiàn)出比Stbl2，Stbl3更優(yōu)異的性能，特別適合慢病毒或具有末端重復序列DNA片段的克隆?；蚪M含有重組酶recA1 rel A1突變，可有效抑制長片段末端重復區(qū)的重組，降低錯誤重組的概率；同時含有核酸酶endA1突變，避免了提取質粒過程中核酸酶的污染，大大提高了高純度病毒質粒的產量和質量。lacZΔM15的存在使Stable可用于藍、白斑篩選，此菌株具有四環(huán)素和鏈霉素抗性，唯地生物開發(fā)的Stable電擊感受態(tài)細胞適用于大質粒的構建或者各種具有末端重復序列的復雜DNA文庫構建，經特殊工藝制作，pUC19質粒檢測轉化效率>2×10¹⁰ cfu/μg DNA。

優(yōu)點及應用

1. Stable菌株與Stbl3相比，基因組含有endA 突變，提高了病毒質粒的產量和純度。

2. Stable菌株比Stbl3生長速度快，倍增時間是Stbl3的1.5倍。

3. Stable菌株基因組中含有fhuA突變，賦予其對噬菌體T1的抗性。

4. Stable菌株具有較高的轉化效率，pUC19檢測轉化效率>5×108 cfu/μg DNA。

5. Stable菌株基因組中含有l(wèi)acZΔM15，可用于藍白斑篩選實驗。

操作方法

1. 0.1cm 電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，使乙醇充分揮發(fā)，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的Stable電擊感受態(tài)細胞插入冰中5 分鐘，待其融化，加入目的DNA (質?；蜻B接產物)并用手撥打EP管底輕輕混勻，避免產生氣泡，立即插入冰中。

A. 測定轉化效率使用1 μl 10 pg/μl的對照質粒 pUC19；

B. 對于連接產物，請用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液 (10mM Tris HCl, pH7.5; 1mM EDTA)重懸，DNA濃度不超過100ng/μl，體積不超過5μl/50μl 感受態(tài)。

3. 用200 μl槍頭將感受態(tài)-DNA混合物快速移到電擊杯中，避免產生氣泡，蓋上杯蓋。

4. 啟動電轉儀，設置參數(shù)：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此為BioRad 電轉儀推薦參數(shù)，也可按所用電轉儀推薦的參數(shù)操作），將電擊杯快速放入電轉槽中，電擊完成快速插入冰中。

5. 2分鐘后從冰中取出電擊杯，放室溫，加入700 μl不含抗生素的無菌S.O.C. 培養(yǎng)基（室溫），用1ml槍吹吸電擊杯底部數(shù)次混勻后，轉移到50ml離心管（BD Falcon50ml錐形離心管等），向離心管中補加S.O.C. 培養(yǎng)基至5ml。30℃，225 rpm復蘇90分鐘。

     當質粒中含有不穩(wěn)定片段時，30℃培養(yǎng)可降低錯誤重組的概率，若轉化control pUC19計算轉化效率，則需37℃，225 rpm復蘇60分鐘

S.O.C 培養(yǎng)基配方

2% Tryptone

0.5% Yeast Extract

10 mM NaCl

2.5 mM KCl

10 mM MgCl2

10 mM MgSO4

20 mM glucose

PH-7.0

S.O.C. Medium is suitable for use in the final step of cell transformation to obtain maximal transformation efficiency of E. coli (Hanahan, 1983).

注意事項

1. 對不穩(wěn)定DNA片段的克隆或逆轉錄病毒/慢病毒載體的構建，涂板后平板應在30℃培養(yǎng)，以減少發(fā)生錯誤重組的概率。

2. 制備高純度病毒質粒時，應使用新鮮轉化的平板接菌，新鮮菌液提取質粒，菌液不可低溫保存后提取質粒。

3. 感受態(tài)細胞最好在冰中緩慢融化。插入冰中10分鐘內加入目標DNA，不可在冰中放置時間過長，長時間存放會降低轉化效率?；烊肽康腄NA時應輕柔操作。

4. 加入DNA時體積不應大于感受態(tài)體積的1/10。

5. 電擊感受態(tài)細胞加入電擊杯應避免產生氣泡，氣泡會增加弧光放電風險。

6. 當DNA不純或存在鹽，乙醇，蛋白及緩沖液等污染時，轉化效率急劇下降。

7. 電擊杯里的離子可增加溶液的電導，增大在含有細胞和DNA的溶液中產生電流和弧光放電的風險。

8. 若轉化大質?；蛳氆@得較高轉化效率，推薦使用高純質粒提取試劑盒提取質粒。質粒增大一倍，轉化效率下降一個數(shù)量級。

9. 對于連接產物轉化，最好轉化前乙醇沉淀DNA后用適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重懸產物，保證DNA濃度不超過100 ng/μl。過高濃度連接產物或過大體積連接產物會降低轉化效率，增加弧光放電的風險。

10. 混入質粒時應輕柔操作，吸取感受態(tài)細胞時避免用力過猛，以免剪切力過大損傷細胞膜，降低轉化效率。轉化高濃度的質?；蜻B接產物可相應減少最終用于涂板的菌量。

11. 電擊感受態(tài)細胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期儲存會導致轉化效率會下降。