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一、試劑盒組成、儲(chǔ)存、穩(wěn)定性 試劑盒組成 保存 50 次 （DP6211） 100 次 （DP6213） 紅細(xì)胞裂解液 室溫 500 ml 1000ml 細(xì)胞核裂解液 室溫 160 ml 320ml 蛋白沉淀液 室溫 55 ml 110ml DNA 溶解液 室溫 20 ml 40ml 蛋白酶 K （20mg/ml） （僅 II 型提供） -20℃ 20mg 凍干粉 20mgx2 凍干粉 凝固柱 室溫 50 個(gè) 100 個(gè) 本試劑盒在室溫儲(chǔ)存 18 個(gè)月不影響使用效果。 注意事項(xiàng) 1． 環(huán)境溫度低時(shí)細(xì)胞核裂解液中某些去污劑成份會(huì)析出出現(xiàn)渾濁或者沉淀，可在 37℃ 水浴加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清，不要?jiǎng)×覔u晃，以免形成過(guò)量的泡沫。 2． 蛋白沉淀液可能出現(xiàn)析出和沉淀，可以在 37℃水浴幾分鐘幫助重新溶解，如果不能 完全溶解，也不影響使用效果，直接取用上層溶液即可。 3． 避免試劑長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、PH 值變化，各溶液使用后應(yīng)及時(shí)蓋 緊蓋子。 二、原理簡(jiǎn)介 本試劑盒根據(jù)全血特點(diǎn)采用幾個(gè)快速步驟提取基因組 DNA。首先紅細(xì)胞 裂解液裂解去除不含 DNA 的紅細(xì)胞，細(xì)胞核裂解液裂解白細(xì)胞釋放出基因 組 DNA, 然后蛋白沉淀液選擇性沉淀去除蛋白，最后純凈的基因組 DNA 通 過(guò)異丙醇沉淀并重溶解于 DNA 溶解液。 三、試劑盒特點(diǎn) 1． 從十幾個(gè)配方中優(yōu)選出的紅細(xì)胞裂解液配方，裂解快速完全。 2． 不需要使用有毒的苯酚等試劑。 3． 快速，簡(jiǎn)捷，適合同時(shí)提取多個(gè)樣品。 4． 結(jié)果穩(wěn)定，產(chǎn)量高（典型的產(chǎn)量 5ml 全血可提取出 75-250μg）， OD260/OD280 典型的比值達(dá) 1.7～1.9，長(zhǎng)度可高達(dá) 50Kb-150kb，可 直接用于構(gòu)建文庫(kù)，PCR，Southern-blot 和各種酶切反應(yīng)。 四、注意事項(xiàng)（實(shí)驗(yàn)前必須首先閱讀這部分?。? 1． 所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到10,000rpm，并配 備容納50ml離心管轉(zhuǎn)頭的傳統(tǒng)臺(tái)式離心機(jī)。 2． 為便于運(yùn)輸。紅細(xì)胞裂解液為 10×，使用時(shí)請(qǐng)稀釋成 1×。用戶需 自備異丙醇和 70％乙醇。 3． 典型的產(chǎn)量 5ml 全血可提取出 75-250μg 基因組 DNA（不同樣品尤 其疾病樣品中中白細(xì)胞數(shù)量差異可能非常大，因此產(chǎn)量的個(gè)體差異 也可能非常大）。 4． 本試劑盒為溶液型，可以很容易的按照比例擴(kuò)大或者縮小每次處理 的全血量（20μl-10ml），請(qǐng)聯(lián)系我們索取其它處理量的操作手冊(cè)。 5． 本試劑盒可運(yùn)用于各種非抗凝劑的全血。 6． 為了最佳效果，最好使用 4℃存放小于 3 天的標(biāo)本，反復(fù)凍融超過(guò) 3 次的標(biāo)本，會(huì)嚴(yán)重降低產(chǎn)量。 7． 對(duì)于每個(gè)樣品提取血量大的客戶或者用量大的客戶，可以和我們聯(lián) 系，我們另有專門準(zhǔn)備有優(yōu)惠的大包裝試劑。 五、操作步驟 1．取解凍后含血凝塊的全血 2ml（或 2g）至離心柱中，5,000rpm 離心 10 分鐘，收集下液。 2． 吸取 6--8ml 紅細(xì)胞裂解液到步驟 1 所得的下液中，用槍吹打混勻后 轉(zhuǎn)入 10ml 的離心管中，蓋緊管蓋，Vortex 2-3 分鐘， 3．室溫放置 10 分鐘（期間應(yīng)該顛倒輕彈混勻數(shù)次或者搖床上面輕搖幫 助裂解紅細(xì)胞），血塊完全溶解。 4．5,000rpm 離心 10 分鐘，棄紅色上清，并小心的盡可能多的吸棄上清 （注意不要吸到管底的細(xì)胞團(tuán)），留下完整的管底白細(xì)胞團(tuán)和大約 100μl 的殘留上清。 離心后在管底應(yīng)該見到白色的白細(xì)胞團(tuán)，也可能有一些紅細(xì)胞殘片和白細(xì)胞團(tuán) 在一起，但是如果看到的是大部分的紅色細(xì)胞團(tuán)，說(shuō)明紅細(xì)胞裂解很不充分， 應(yīng)該再加入適量紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞團(tuán)后重復(fù)步驟 3，4。 5. 渦旋振蕩 25 秒重懸白細(xì)胞團(tuán)，充分分散白細(xì)胞團(tuán)。 6． 加入 2--3ml 細(xì)胞核裂解液到重懸的白細(xì)胞中，再加入 20ul 蛋白酶 K （20mg/ml）,適度吹打幾次混勻，以裂解白細(xì)胞，由于有部分基因 組 DNA 釋放出來(lái)，這個(gè)時(shí)候混合物會(huì)變得十分粘稠，立刻停止吹 打（以免剪切斷基因組 DNA），在 60℃溫育 3-4 小時(shí)（或 55℃過(guò)夜 消化）至裂解完全，期間輕微顛倒混勻數(shù)次。若還沒有裂解，可直 接離心取上清。注:(由于提取的血樣樣品有差異，所以可以做兩手準(zhǔn)備， 一種是加蛋白酶 K 的消化，一種是不加蛋白酶 K 的消化，如果結(jié)果差別不大， 從節(jié)約試驗(yàn)耗材來(lái)看，還是不加蛋白酶 K 的更劃算。) 7．恢復(fù)室溫后加入 1.5ml 蛋白沉淀液后，在渦旋振蕩器上高速連續(xù)振蕩混勻 20-25 秒。混勻后可能見到一些小的蛋白團(tuán)塊。 由于樣品體積重量小，用渦旋振蕩器振蕩混勻產(chǎn)生的剪切力并不會(huì)剪切打斷基 因組 DNA，如果用手振蕩混勻，則不可以用手上下劇烈振蕩混勻，只能適當(dāng)力 度振蕩混勻，否則會(huì)剪斷基因組 DNA，但是力度也不能小,要保證充分混勻，將 粘稠的裂解物打散開，否則 DNA 無(wú)法和蛋白質(zhì)沉淀分離開， 離心的時(shí)候會(huì)和 蛋白質(zhì)一起沉淀下來(lái)，造成 DNA 丟失或者降低產(chǎn)量。此外混勻不充分也可能造 成蛋白沉淀不充分, 最后的產(chǎn)物污染有較多量的蛋白質(zhì)。因此建議新手還是用渦 旋振蕩器混勻。 8．5,000rpm (可根據(jù)離心效果(沉淀如果不緊)調(diào)整加大離心力)離心 10 分鐘。這時(shí)候應(yīng)該可以見到管底暗褐色的蛋白沉淀，也可能見到一些 蛋白沉淀漂浮在液體表面。 9．小心吸取上清（大約 3.5ml）到一個(gè)新的 10ml 離心管中。 吸取上清時(shí)小心不要吸到管底的和漂浮在液體表面的蛋白沉淀，如果不小心將 蛋白沉淀轉(zhuǎn)入新的離心管中，可再次離心 2 分鐘后取上清。 10．加入等體積的室溫異丙醇（約 3.5ml），輕柔顛倒 30 次混勻或者直到 出現(xiàn)棉絮狀（絲狀）白色 DNA 沉淀。 注意有時(shí)候棉絮狀（絲狀）DNA 沉淀顛倒混勻的時(shí)候，粘附著在蓋子或者管口 處，即使顛倒也不跟下來(lái)，或者附著有氣泡導(dǎo)致漂浮在液面，這樣導(dǎo)致操作者 看不到沉淀，誤認(rèn)為沒有得到 DNA。解決辦法是略去步驟 11，直接 5，000 rpm 離心 5 分鐘，棄上清，然后接步驟 13。 11．垂直放置離心管，讓白色 DNA 沉淀自然沉到管底，然后盡可能多的 吸棄大部分的上清，注意不要吸到沉淀。 12．加入 3ml70％乙醇后，顛倒混勻，5,000rpm 離心 5 分鐘，在管底可 以見到白色的 DNA 沉淀塊，倒棄上清。 13．加入 3ml70％乙醇，顛倒幾次漂洗 DNA 沉淀，5,000rpm 離心 5 分鐘, 倒去上清（沉淀很松，注意不要把 DNA 沉淀倒掉了），倒置后在吸 水紙上輕敲幾下以控干殘留乙醇，還可以用槍頭小心吸掉管底沉淀 周圍和管壁的殘留乙醇，空氣晾干沉淀幾分鐘。 注意不要干燥過(guò)頭，否則 DNA 極其難溶，也不能殘留太多乙醇，否則乙醇可能 抑制下游如酶切反應(yīng)。 14．加入 250μlDNA（或者根據(jù)濃度需要調(diào)整用量）溶解液重新水化溶 解 DNA 沉淀，輕彈管壁混勻，可以放置在 65℃溫育 30-60 分鐘（不 要超過(guò)一小時(shí)），也可以在室溫或者 4℃放置過(guò)夜來(lái)重新水化 DNA， 中間不時(shí)的輕彈管壁幫助重新水化 DNA。 15. DNA 可以存放在 2-8℃,如果要長(zhǎng)時(shí)間存放，可以放置在-20℃。 六、疑難解答（Trouble shooting） 見下頁(yè)表格 出現(xiàn)的問題 可能的原因 建議解決方法 標(biāo)本中含有血凝塊 不恰當(dāng)?shù)拇娣艠?biāo)本，未充 分混勻，未使用合適的抗 凝收集管 丟棄有血凝塊的標(biāo)本，重新用 EDTA,肝素，檸檬酸抗凝管收集血 液。 紅細(xì)胞裂解不完全 血液標(biāo)本裂解前沒有回復(fù) 到室溫 處理前先把血液標(biāo)本回復(fù)到室 溫。 裂解時(shí)間不夠 可延長(zhǎng)裂解時(shí)間至 15 分鐘以上。 裂解過(guò)程中沒有多次混勻 裂解過(guò)程中可以更多次顛倒混 勻，或者輕彈管壁幫助裂解。 DNA產(chǎn)量低 血液標(biāo)本中本身含有的白 細(xì)胞數(shù)量低 增加起始血液處理量 白細(xì)胞裂解不完全 仔細(xì)閱讀步驟 6 的操作要領(lǐng)。加 入裂解液之前，必須劇烈渦旋振 蕩打散重懸白細(xì)胞沉淀團(tuán)塊，否 則很難裂解完全。如果是肝素抗 凝的血樣，白細(xì)胞團(tuán)塊很難打散， 加入裂解液后應(yīng)該在 65℃溫育幫 助裂解直到看不見細(xì)胞團(tuán)塊。白 細(xì)胞數(shù)量太大超出裂解能力，適 當(dāng)增加細(xì)胞核裂解液體積。 血液標(biāo)本存放時(shí)間太長(zhǎng) 存放在4℃的血液標(biāo)本超過(guò)5天的 產(chǎn)量可能大大降低，因此不要存 放太久。 DNA 沉淀在洗滌的時(shí)候 丟失了 異丙醇沉淀后用乙醇洗滌的過(guò)程 中，倒棄上清的時(shí)候要格外小心， 不要把 DNA 沉淀也倒掉了。 接前表 出現(xiàn)的問題 可能的原因 建議解決方法 DNA長(zhǎng)度小于30kb 血液樣品太老或者不正確 的存放，造成 DNA 降解 選用新鮮的血液樣品。 操作不當(dāng)，造成對(duì)基因組 DNA 的剪切 混勻輕柔，不可以用手劇烈振蕩離心 管，選用大口徑的槍頭轉(zhuǎn)移或者混勻 DNA。 未見到蛋白沉淀 加入蛋白沉淀液前，裂解 混合物沒有冷卻回室溫 冷卻至室溫或者冰上放置 5 分鐘后 再加入蛋白沉淀液。 蛋白沉淀液沒有和裂解混 合物充分混勻 應(yīng)該連續(xù)高速渦旋振蕩混勻 25 秒， 渦旋并不會(huì)剪切斷 DNA。 A260/A280 <1.6 污染有蛋白質(zhì) 看看上述“未見到蛋白沉淀”問題的 解決方法，確保蛋白通過(guò)沉淀去除。 另外請(qǐng)參見步驟 9，防止蛋白污染。 測(cè)定吸光值時(shí)用水稀釋 DNA 會(huì)降低 A260/A280 使用TE緩沖液來(lái)稀釋DNA,保證PH 值大于 8.0。 DNA沉淀難以重新 溶解水化 晾干 DNA 沉淀時(shí)過(guò)度了 晾干時(shí)候密切觀察，不要干燥過(guò)頭， 注意應(yīng)該觀察管底的 DNA 沉淀，有 時(shí)候管壁上的殘留乙醇已經(jīng)揮發(fā)，但 留下一些水分還沒有干，只要管底 DNA 干了就可以加入 DNA 溶解 液。可在 65℃溫育幫助重新溶解（不 要超過(guò)一小時(shí)）然后室溫或者 4℃放 置過(guò)夜，期間可以顛倒輕彈幫助溶 解。 下游酶切切不開 DNA 未干燥完全，殘留乙 醇太多 敞開離心管口，在 65℃溫育幾分鐘， 讓乙醇揮發(fā)