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產(chǎn)品說明:

         本試劑盒是高靈敏度、高特異性擴增cDNA 3′末端全長的試劑盒。對RNA結構進行分析時，一般先通過RT-PCR反應擴增目的區(qū)域，然后再對擴增出的目的DNA片段進行克隆、序列分析等。一般的RT-PCR反應很難得到全長的cDNA片段，而RACE法能有效地解決這一問題。Bioteke公司生產(chǎn)的3’RACE試劑盒能夠通過已知的cDNA序列，高靈敏度、高特異性地擴增cDNA的3′末端的全長序列。本試劑盒中含有完成3′-RACE操作的主要試劑。試劑盒中使用的Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）經(jīng)過了本公司的特殊改良，反轉(zhuǎn)錄性能良好，無RNase H活性，大大增加了反轉(zhuǎn)錄性能。進行3′RACE 實驗時，首先由Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后再使用Bioteke LA Taq，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進行套式PCR反應。3′RACE Adaptor作為反轉(zhuǎn)錄引物用于合成1st Strand cDNA；使用基因上游外側(cè)特異性引物1和3′RACE Primer 1進行1st PCR反應。如果1st PCR反應未能得到目的產(chǎn)物，再使用基因上游內(nèi)側(cè)特異性引物2和3′RACE Primer 2進行2nd PCR反應。PCR產(chǎn)物可以直接進行DNA測序或TA克隆。

 

產(chǎn)品組成：

 

制品可用于20次反轉(zhuǎn)錄反應（約100次3′RACE PCR反應）

 

實驗時需要自備的其他試劑：擴增目的DNA片段的上游特異性引物；PCR用DNA聚合酶。我們推薦使用Bioteke LA Taq，也可以根據(jù)實驗需要選用其他PCR用DNA聚合酶。

 

試劑盒注意事項:

◆ 同時需要進行數(shù)次反轉(zhuǎn)錄反應或PCR反應時，應先配制各種試劑的混合液（Master Mix；其中包括RNase Free dH2O、Buffer、dNTP Mixture等），然后再分裝到每個反應管中。這樣，可使所取的試劑體積更準確，減少試劑損失，避免重復分取同一試劑。同時也可以減少實驗操作或?qū)嶒炛g產(chǎn)生的誤差。

◆ 使用Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）、RNase Inhibitor等酶類時，應輕輕混勻，避免起泡，分取之前要小心地離心收集到反應管底部。由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取時應慢慢吸取。從-20℃中取出，使用后也應立即放回-20℃中保存。

 

問題解答

1. RT-PCR反應后，無PCR產(chǎn)物或出現(xiàn)Smear，怎么辦？

此時請從提取的RNA樣品的純度和添加量、基因的表達豐度、基因的長度和GC含量、引物的設計情況、參考文獻的可信度以及RT-PCR條件的設定等方面加以考慮。

2. PCR反應時，反轉(zhuǎn)錄反應液的使用量使用多少較為合適？

 反轉(zhuǎn)錄反應液的使用量可控制在1μl～10μl的范圍。

3. 3′RACE PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳分析后，有時為什么出現(xiàn)多條帶現(xiàn)象？

可能是因為未知序列信息不清楚導致了非特異性擴增； 擴增的基因為多基因家族的成員；mRNA不同的拼接方式造成的。