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一、試劑盒組成、儲存、穩(wěn)定性 試劑盒組成 保存 50 次 （DP5301） 緩沖液 VB 室溫 5 ml 病毒結(jié)合液 室溫 30 ml 蛋白酶 K（20mg/ml） -20℃ 20mg Carrier RNA 室溫 300ul 去蛋白液 RE 室溫 30 ml 漂洗液 RW 4℃（一個(gè)月） -20℃（長期） 15 ml 第一次使用前請加入指定量乙醇 Wash buffer 室溫 10 ml 微量吸附柱 RA 室溫 50 個(gè) 收集管（2ml） 室溫 50 個(gè) 本試劑盒在室溫儲存 12 個(gè)月不影響使用效果。 注意事項(xiàng) 1． 第一次使用前請先在漂洗液 RW 中加入指定量乙醇(15ml RW 瓶加 60ml)，充分混勻， 加入后請及時(shí)在方框打鉤標(biāo)記已加入乙醇，以免多次加入! 2． 為避免降低活性，方便運(yùn)輸，提供 20mg 蛋白酶 K 為凍干粉狀，使用時(shí)可短暫離心 后，加入 1 毫升滅菌水溶解(20mg/ml 終濃度)。因?yàn)榉磸?fù)凍融可能會降低酶活性， 因此溶解后立即按照每次使用量(20 微升)分裝凍存，-20℃保存。 3． 避免試劑長時(shí)間暴露于空氣中發(fā)生揮發(fā)、氧化、PH 值變化，各溶液使用后應(yīng)及時(shí) 蓋緊蓋子。 二、原理簡介 獨(dú)特的結(jié)合液/蛋白酶 K 迅速裂解病毒和滅活病毒內(nèi)核酸酶，然后基因組 DNA 和 RNA 在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜， 再通過一系 列快速的漂洗－離心的步驟, 抑制物去除液和漂洗液將細(xì)胞代謝物、蛋白等 雜質(zhì)去除，最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組 DNA 和 RNA 從硅基質(zhì)膜上洗 脫。 三、試劑盒特點(diǎn) 1． 不需要使用有毒的苯酚等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。 2． 快速，簡捷，單個(gè)樣品操作一般可在 30 分鐘內(nèi)完成。 3． 多次柱漂洗確保高純度,無抑制性雜質(zhì)。 4． 本試劑盒用于從新鮮或者冷凍的血漿、血清、全血和其它無細(xì)胞體 液等樣品中提取病毒基因組 DNA 和 RNA,冷凍樣品不要反復(fù)凍融。所 得樣品可以直接用于 PCR、酶切、雜交等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。 四、注意事項(xiàng)（實(shí)驗(yàn)前必須首先閱讀這部分?。? 1． 所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13，000 rpm的 傳統(tǒng)臺式離心機(jī)，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機(jī)。 2． 開始實(shí)驗(yàn)前將需要的水浴先預(yù)熱到 70℃?zhèn)溆谩? 3． 為了最佳效果，最好使用新鮮液體標(biāo)本并且避免反復(fù)凍融，否則會 使提取片段較小并嚴(yán)重降低產(chǎn)量。 五、操作步驟 * 第一次使用前請先在漂洗液 RW 中加入指定量無水乙醇! 1. 取 200μl 含病毒的液體（血清、血漿、全血等），放入 1.5ml 離心管。 對如果液體起始量小于200μl，則用緩沖液VB補(bǔ)足到200μl。如果起始量介于 200μl-300μl之間，則后續(xù)操作需要按照比例增加試劑用量。對于組織樣本 應(yīng)當(dāng)先研磨，然后用200ul的緩沖液VB重懸，然后在加到病毒裂解液中。 2. 加入600μl 的病毒結(jié)合液，加入20μl蛋白酶K(20mg/ml)溶液，6ul的 核酸助沉劑，振蕩15秒，充分混勻，65℃水浴15分鐘，期間顛倒混 勻3-4次，直到溶液應(yīng)清亮為止。 3. 加入100μl 無水乙醇，上下顛倒，充分混勻，此時(shí)可能會出現(xiàn)絮狀 沉淀。 上述各操作步驟中適當(dāng)力度充分混勻非常重要，混勻不充分嚴(yán)重降低產(chǎn)量。 4. 將上一步所得溶液和可能的絮狀沉淀分兩次加入一個(gè)吸附柱RA中， （吸附柱放入收集管中）10,000 rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢 液。 5. 加入600μl去蛋白液RE，12,000 rpm 離心30秒，棄廢液。 6. 加入 700μl 漂洗液 RW（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000 rpm 離心 30 秒，棄掉廢液。 7. 將吸附柱 RA 放回空收集管中，13,000 rpm 離心 2 分鐘，盡量除去 漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。 8. 取出吸附柱 RA，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加 30-50μl Wash buffer（Wash buffer 事先在 65-70℃水浴中預(yù)熱）， 室溫放置 2 分鐘，12,000 rpm 離心 1 分鐘。將得到的溶液重新加入 離心吸附柱中，室溫放置 2 分鐘，12,000 rpm 離心 1 分鐘。 9. DNA 可以存放在 2-8℃,如果要長時(shí)間存放，可以放置在-20℃。RNA 最好直接反轉(zhuǎn)錄成 CDNA 保存，或者 RNA 保存于-80°C。