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一、試劑盒組成、儲(chǔ)存、穩(wěn)定性 試劑盒組成 保存 10 次 （DP2011） 緩沖液 RB 室溫 45 ml 結(jié)合液 CB 室溫 22 ml 抑制物去除液 IR 室溫 50 ml 漂洗液 WB 室溫 25 ml 第一次使用前按說(shuō)明加指定量乙醇 洗脫緩沖液 EB 室溫 15 ml 異丙醇 室溫 15 ml 過濾柱 室溫 10 個(gè) 吸附柱 AC 室溫 10 個(gè) 收集管（2ml） 室溫 10 個(gè) 本試劑盒在室溫儲(chǔ)存 12 個(gè)月不影響使用效果。 注意事項(xiàng) 1． 第一次使用前請(qǐng)先在 25ml 漂洗液 WB 中加入 100ml 無(wú)水乙醇，充分混勻，加入后請(qǐng) 及時(shí)在方框打鉤標(biāo)記已加入乙醇，以免多次加入! 2． 結(jié)合液 CB 或者抑制物去除液 IR 低溫時(shí)可能出現(xiàn)析出和沉淀，可以在 37℃水浴 幾分鐘幫助重新溶解，恢復(fù)澄清透明后冷卻到室溫即可使用。 3． 請(qǐng)自備蛋白酶 K(20mg/ml)，-20℃保存。 4． 避免試劑長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、PH 值變化，各溶液使用后應(yīng)及時(shí)蓋 緊蓋子。 二、原理簡(jiǎn)介 獨(dú)特的結(jié)合液/蛋白酶 K 迅速裂解細(xì)胞和滅活細(xì)胞內(nèi)核酸酶，然后基因組  DNA 在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜， 再通過一系列快 速的漂洗－離心的步驟, 抑制物去除液和漂洗液將細(xì)胞代謝物，蛋白等雜質(zhì) 去除， 最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組 DNA 從硅基質(zhì)膜上洗脫。 三、試劑盒特點(diǎn) 1． 離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜全部采用進(jìn)口世界著名公司特制吸附膜，柱 與柱之間吸附量差異極小，可重復(fù)性好?？朔藝?guó)產(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量 不穩(wěn)定的弊端。 2． 不需要使用有毒的苯酚等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。 3． 快速，簡(jiǎn)捷，單個(gè)樣品操作一般可在 60 分鐘內(nèi)完成。 4． 多次柱漂洗確保高純度，OD260/OD280 典型的比值達(dá) 1.7～1.9，長(zhǎng) 度可達(dá) 30Kb-50kb，可直接用于 PCR，Southern-blot 和各種酶切反應(yīng)。 四、注意事項(xiàng)（實(shí)驗(yàn)前必須首先閱讀這部分?。? 1． 所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13，000 rpm的帶 50ml轉(zhuǎn)子的傳統(tǒng)臺(tái)式離心機(jī)。 2． 開始實(shí)驗(yàn)前將需要的水浴先預(yù)熱到 70℃?zhèn)溆谩? 3． 對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌，需要自備 lysozyme，或者 lysostaphin。 4． 結(jié)合液 CB 和抑制物去除液 IR 中含有刺激性化合物，操作時(shí)要戴 乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要 用大量清水或者生理鹽水沖洗。 五、操作步驟 * 第一次使用前請(qǐng)先在 25ml 漂洗液 WB 中加入 100ml 無(wú)水乙醇! 1． 取 5-20 毫升培養(yǎng)菌液（最多不超過 2×1010 個(gè)細(xì)胞），10,000rpm，離 心 10 分鐘左右，棄上清，收集菌體，盡可能的吸凈上清。 起始處理量可以根據(jù)細(xì)菌密度，細(xì)胞種類，預(yù)期產(chǎn)量進(jìn)行調(diào)整，但是離心吸附 柱最大吸附能力 250μg 基因組 DNA，如果菌體過量超過最大吸附能力，反而會(huì) 嚴(yán)重降低產(chǎn)量。 2． 加入 2ml 緩沖液 RB 重懸洗滌細(xì)胞，移液器吹打或者渦旋振蕩至徹 底懸浮。 3． 對(duì)于革蘭氏陰性菌（可選做此步驟）：加入 50μl lysozyme (10mg/ml in 10 mM Tris-HCl,pH 8.0) ，顛倒混勻，37℃溫育 15 分鐘。 對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌：加入 500μl-1000μl lysozyme (10mg/ml in 10 mM Tris-HCl,pH 8.0)顛倒混勻， 37℃溫育 30-60 分鐘。10,000rpm 離心 2 分鐘，棄上清后將細(xì)胞振蕩或者吹打重懸于 2ml 緩沖液 RB 中。 對(duì)于大部分的革蘭氏陽(yáng)性菌如 Bacillus subtilis,Micrococcus luteus,Arthrobacter luteus,Nocardia otitidiscaviarum,Rhodococcus rhodochrous, 和 Brevibacterium albidium 使用溶菌酶就可以有效裂解。但是對(duì)于某些種類的 Staphylococcus,則應(yīng) 該加入 250μl 溶菌酶(10mg/ml)和 250μl lysostaphin (10mg/ml)確保有效裂解。 4． 可選做步驟：如果 RNA 殘留較多，需要去除 RNA，可以加入 200μl RNase A(25mg/ml)溶液，振蕩混勻，室溫放置 5-10 分鐘。 5． 加入 2ml 結(jié)合液 CB，立刻劇烈顛倒輕搖充分混勻，再加入 200μl 蛋 白酶 K (20mg/ml)溶液，充分混勻，70℃放置 15 分鐘。 6． 將上步所得的混合液加入到過濾柱中，低速（4000rpm 左右）離心 5 分鐘，收集下濾液。 7． 下濾液冷卻后加入 1ml 異丙醇，劇烈顛倒輕搖充分混勻，此時(shí)可能 會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。 8． 將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱 AC 中，（吸附柱放 入收集管中）10,000 rpm 離心 3 分鐘，倒掉收集管中的廢液。 上述各步驟中適當(dāng)力度充分混勻非常重要，混勻不充分嚴(yán)重降低產(chǎn)量，必要時(shí)如 樣品粘稠不易混勻時(shí)可以渦旋振蕩 15 秒混勻。 9． 加入 5ml 抑制物去除液 IR，10,000 rpm 3 分鐘，棄廢液。 10．加入 7ml 漂洗液 WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇!），10,000 rpm 離心 3 分鐘，棄掉廢液。 11．加入 5ml 漂洗液 WB，10,000 rpm 離心 3 分鐘，棄掉廢液。 12．將吸附柱 AC 放回空收集管中，10,000 rpm 離心 5 分鐘，盡量除去 漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。 13．取出吸附柱 AC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位 加 1-1.5ml 洗脫緩沖液 EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水浴中預(yù)熱）， 室溫放置 3 分鐘，12,000 rpm 離心 3 分鐘。將得到的溶液重新加入 離心吸附柱中，室溫放置 2 分鐘，12,000 rpm 離心 3 分鐘。 洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要 DNA 濃度較高，可以適當(dāng)減少洗脫體 積， 但是最小體積不應(yīng)少于 500μl，體積過小降低 DNA 洗脫效率，減少 DNA 產(chǎn)量。 14．DNA 可以存放在 2-8℃,如果要長(zhǎng)時(shí)間存放，可以放置在-20℃。 六、疑難解答（Trouble shooting） 出現(xiàn)的問題 可能的原因 建議解決方法 DNA產(chǎn)量低 蛋白酶 K 失效了 收到蛋白酶 K 后，按照每次使用 量分裝凍存，避免反復(fù)凍融。 裂解不完全或者和異丙醇 沒有充分混勻 加入結(jié)合液后，和加入蛋白酶 K 后立即劇烈顛倒輕搖混勻。 加入異丙醇后應(yīng)該和裂解物劇烈 顛倒輕搖混勻才加入吸附柱，如 果太粘稠必須渦旋振蕩 15 秒充分 混勻。 有的革蘭氏陽(yáng)性菌需要特 殊的酶裂解 請(qǐng)?jiān)敿?xì)參見步驟 3，了解提取細(xì)菌 的特性 未提取到 DNA 漂洗液 WB 中忘記加無(wú)水 乙醇 第一次實(shí)驗(yàn)時(shí)，在漂洗液 WB 中 加入指定量無(wú)水乙醇。 洗脫下來(lái)的DNA產(chǎn)量 低 離心柱殘留有較多乙醇或 者底部不慎重沾有乙醇 確保做了步驟 12，否則殘留乙醇 會(huì)影響洗脫效率。 使用了水或者其它非最佳 液體代替洗脫緩沖液 仔細(xì)閱讀步驟 13 和只使用洗脫緩 沖液 EB 洗脫。 A260吸光值異常偏高 一些硅基質(zhì)膜成分一起洗 脫下來(lái)，干擾了吸光值 將洗脫的基因組 DNA 溶液 13， 000rpm 再離心一分鐘，小心取上 清使用。 DNA下游酶切不能 切開或者酶切不完 全 一些硅基質(zhì)膜成分一起洗 脫下來(lái)，抑制了酶切反應(yīng) 將洗脫的基因組 DNA 溶液 13， 000rpm 再離心一分鐘，小心取上 清使用。 離心柱殘留有較多乙醇或 者底部不慎沾有乙醇抑制 了酶切反應(yīng) 確保做了步驟 12，然后空氣中晾 幾分鐘，讓殘留乙醇揮發(fā)。